Gestione del campione per esami biomolecolari nei pet birds

Nei post precedenti di questa rubrica ho parlato dell’importanza di un corretto campionamento per effettuare esami diagnostici negli uccelli ornamentali.

Ho fornito alcune indicazioni pratiche sulle modalità di gestione del campione per esami diagnositici nei pet birds, oltre ad aver approfondito aspetti specifici che riguardano gli esami virologici.

Ribadisco ancora una volta che gli esami colturali sono esami che richiedono una particolarissima attenzione nel campionamento e trasporto e in genere sono molto costosi. Vanno quindi richiesti per una finalità specifica (possibilità di caratterizzazione completa genotipica e fenotipica del microrganismo, produzione di vaccini stabulogeni, etc.) o quando non è possibile eseguire altre metodiche diagnostiche.

Oggi sono disponibili metodiche biomolecolari (PCR o RT-PCR) per i principali agenti patogeni degli uccelli d’affezione (Polyomavirus, Circovirus, Herpesvirus, Adenovirus, Toxoplasma, Atoxoplasma, Clamidia, Micobatteri, Clostridi, per es.). Attraverso questi test arrivare a formulare una diagnosi eziologica precisa.

Vantaggi delle metodiche biomolecolari

I vantaggi di queste nuove metodiche sono:

• tempi di esecuzione molto rapidi;
• elevata sensibilità (permettono quindi di individuare il microrganismo per più tempo e anche a concentrazioni molto ridotte);
• modalità di campionamento più facili;
• non occorre che il microrganismo sia vitale per essere individuato.

Rimane in ogni caso per il veterinario che formula il sospetto diagnostico la necessità di prelevare il campione più idoneo, ossia quello che – in base alle caratteristiche del microrganismo e alla patogenesi della malattia – offre maggiori chance di individuare l’agente patogeno.

Campioni per esami biomolecolari

Per questo tipo di esami si possono prelevare tamponi secchi, pezzetti di organo o fluidi organici e trasportarli in contenitori sterili anche a temperatura ambiente, se arrivano in laboratorio nel giro di poche ore dal prelievo.

Molto utilizzate negli ultimi anni sono le FTA card: dei cartoncini in cui, in un punto ben preciso evidenziato del cartoncino stesso, è possibile depositare piccole quantità di campione (sangue, fluidi organici, omogenati e strisci d’organo). Le FTA card contengono composti in grado di lisare le cellule, denaturare le proteine e proteggere gli acidi nucleici dai danni dovuti agli enzimi cellulari, all’ossidazione e all’azione dei raggi ultravioletti.

Inoltre inattivano rapidamente batteri e altri microrganismi (compreso l’agente eziologico cercato) impedendone la crescita. In questo modo è possibile inviare il campione in laboratorio senza rischi di tipo biologico, ma ovviamente non possono essere usate per l’isolamento. Il DNA o l’RNA raccolto sulle FTA card rimane stabile per diversi mesi a temperatura ambiente.

Errori frequenti da evitare

Anche per gli esami biomolecolari occorre evitare di commettere alcuni errori frequenti che possono essere alla base di un’errata diagnosi, generando falsi negativi o falsi positivi.

Principali motivi di falsi negativi con esami biomolecolari

• Errata selezione del campione o momento del prelievo
  Come per gli altri esami, nonostante la maggiore sensibilità delle metodiche biomolecolari, sbagliare in fase di campionamento può portare a un esito negativo dell’esame.

• Acidi nucleici degradati
  Campioni prelevati da animali non morti di recente o conservati/trasportati a temperature elevate, in cui le nucleasi endogene o proteasi esogene (per esempio batteriche) hanno rovinato gli acidi nucleici, possono risultare negativi. È sempre raccomandabile, anche per questi test, trasportare i campioni refrigerati e nel minor tempo possibile.

• Presenza di inibitori della PCR
  Alcuni organi (per esempio fegato o pancreas) sono ricchi di sostanze che inibiscono la PCR, quindi se è possibile selezionare o abbinare un altro organo in cui può essere presente il microrganismo e trasportare i campioni refrigerati e nel minor tempo possibile. Altri esempi di inibitori della PCR sono l’eparina usata come anticoagulate (se possibile usare l’EDTA o il citrato sodico) ed il calcio-alginato presente in alcuni tamponi .

Principali motivi di falsi positivi con esami biomolecolari

• Contaminazione del campione
  L’elevata sensibilità di queste metodiche espone facilmente al rischio di contaminazione. È quindi molto importante, specie quando si fanno prelievi in più soggetti contemporaneamente, utilizzare una strumentazione diversa per ogni soggetto e non toccare i differenti contenitori in cui andranno riposti i campioni con guanti o attrezzature potenzialmente contaminate.

• Presenza di acidi nucleici simili a quello del patogeno cercato
  È possibile avere nel campione del genoma che possa assomigliare in alcuni tratti a quello del patogeno cercato, quindi rischiare di avere delle positività aspecifiche. È fondamentale quindi rivolgersi a laboratori che adottino procedure validate e quindi testate per la specificità.

La microscopia elettronica

La ricerca di agenti virali può essere effettuata anche tramite la microscopia elettronica. A questo proposito, nelle specie d’affezione per le quali sono spesso limitati gli strumenti diagnostici, il microscopio elettronico risulta essere un’ottima tecnica diagnostica in grado di visualizzare direttamente i virus da campioni clinici quali feci, organi, tessuti.

Ha il vantaggio di individuare molti virus difficili da isolare con tecniche culturali standard (nei passeriformi per esempio Citomegalovirus, Herpesvirus, Reovirus Adenovirus, Poxvirus, Polyomavirus, Papillomavirus e Circovirus), e può permettere di dimostrare la presenza di più virus contemporaneamente (come nel caso di enteriti virali).

Il campione per esami al microscopio elettronico

Come detto, il campione per gli esami al ME può essere costituito da pezzetti di organo target della virosi messi in contenitori puliti e trasportati anche a temperatura ambiente, se arrivano in laboratorio nel giro di poche ore.

Attenzione però a selezionare correttamente il campione. Il microscopio elettronico è in grado di visualizzare i virus solo se presenti in quantità elevata, quindi occorre individuare e prelevare le parti di organi dove si presume sia stata maggiore la replicazione virale, ossia aree con lesioni evidenti (aree degenerate, proliferative, emorragiche).

In genere con il microscopio elettronico si hanno buoni risultati nelle infezioni acute causate da virus con spiccato tropismo per gli organi parenchimatosi o per le mucose (epatiti , polmoniti, enteriti, tracheiti, orofaringiti virali). Nel caso di lesioni cutanee o delle mucose di tipo vaioloso o erpetico occorre prelevare direttamente le vescicole o le pustole recenti evitando quelle secche.

La consulenza del laboratorio

Come sottolineato anche nei post precedenti, data l’importanza che riveste la scelta dell’esame, l’allestimento, la conservazione e il trasporto del campione per effettuare una corretta diagnosi, è sempre consigliabile che il veterinario clinico prenda contatto con il laboratorio di fiducia prima di effettuare il campionamento.

Questo garantisce di non commettere errori che possono compromettere l’esito o l’esecuzione stessa dei test che si vogliono richiedere.

Presso l’Istituto Zooprofilattico Sperimentale delle Venezie i laboratori delle diverse strutture (diagnostica, batteriologia, parassitologia, virologia) sono a disposizione per fornire il supporto tecnico richiesto, ed eventualmente il materiale e i terreni più idonei per i vari esami.