Gestione del campione per esami diagnostici nei pet birds

Tra le cause principali di un’errata diagnosi di laboratorio, o meglio dell’impossibilità di confermare con specifici esami il sospetto diagnostico (la cosiddetta “quota residua di errore analitico”), ci sono numerose variabili pre-analitiche.

Le metodiche d’indagine e le tecnologie correlate hanno raggiunto un notevolissimo livello di affidabilità, che può essere compromesso se a queste non si affianca altrettanta accuratezza nelle procedure di raccolta, selezione, trasporto e conservazione del campione.

In questo articolo presenterò alcune indicazioni sulle modalità di prelievo, conservazione e consegna di campioni per i principali esami diagnostici che riguardano gli uccelli ornamentali.

Avere le idee chiare

Prima di inviare i campioni in un laboratorio il veterinario clinico che formula il sospetto diagnostico deve avere chiaro:

La scelta dell’esame deve basarsi sulle informazioni che ogni tipo di esame è in grado di fornire. Dal tipo di esame dipende anche il tipo di campione da prelevare e la modalità con cui prelevarlo, conservarlo e trasportarlo.

1) Che tipo di esame richiede al laboratorio

Per esempio: test immunoenzimatico, biomolecolare, esame batteriologico colturale, isolamento virale, istologico, citologico, etc.

La scelta dell’esame deve basarsi sulle informazioni che ogni tipo di esame è in grado di fornire. Dal tipo di esame dipende anche il tipo di campione da prelevare e la modalità con cui prelevarlo, conservarlo e trasportarlo.

2) Quali sono le caratteristiche dell’agente eziologico che si sospetta

Ogni microrganismo ha un suo modo diverso di infettare l’ospite per quanto riguarda la via d’ingresso, gli organi in cui replica, le vie da cui viene eliminato, la modalità con cui viene eliminato, il tempo di persistenza nei differenti organi/apparati.

Varia è anche la resistenza all’ambiente esterno, sia del microrganismo sia dei tessuti in cui replica. Da questo dipende la possibilità di individuare il microrganismo tramite esami di laboratorio che ne richiedono una conservata vitalità o integrità del suo materiale genetico, o che necessitano di un mantenimento della struttura dei tessuti e delle cellule infettate.

3) Che possibilità si hanno di effettuare un corretto campionamento, mantenimento e trasporto del campione

Se non si dispone di idonei terreni di trasporto o non si riesce a far arrivare in campione nei modi e nei tempi idonei per tentare alcuni tipi di esami, occorre dirottare la scelta su altri test meno esigenti.

4) Quanto si può o si vuole spendere

Alcuni esami sono molto costosi, quindi se non strettamente necessari, possono molto spesso essere sostituti da altri più economici ma sufficienti a confermare il sospetto diagnostico.

Vediamo di analizzare in maniera più approfondita questi punti.

I campioni per ogni tipo di esame

Il tipo di esame da richiedere dipende da alcuni fattori quali:

• agente eziologico sospettato
• metodiche disponibili
• fase dell’infezione
• eventuale terapia che si è intrapreso
• tipo d’informazione che si vuole ricavare

Per ogni tipo di esame può cambiare il campione da prelevare e la modalità con cui prelevarlo, conservarlo e trasportarlo.

Esami batteriologici colturali

Nel caso si vogliano richiedere esami batteriologici colturali è preferibile prelevare i campioni prima di intraprendere una terapia antibiotica. Se l’animale è sottoposto a trattamento antimicrobico e non è possibile sospendere la terapia, occorre indicarlo nella richiesta.

Tra i batteri più esigenti dal punto di vista del campionamento ci sono i campylobacter, i micoplasmi, i micobatteri, le clamidie e i clostridi. Questi microrganismi richiedono temperature, condizioni ambientali e terreni di trasporto specifici.

Bisogna utilizzare tamponi sterili con specifici terreni di trasporto, che riescono a mantenere vitali i microrganismi e nello steso tempo evitano le crescite batteriche indesiderate.

Fare attenzione ad ogni contaminazione esogena del campione. I terreni di trasporto sono stati creati per proteggere i microrganismi da essicazione, acidi grassi tossici condizioni sfavorevoli di pH, effetti letali dell’ossigeno atmosferico Per la raccolta e conservazione dei campioni batteriologici i più usati sono:

• Terreno di Stuart
• Terreno di Amies
• Terreno Cary-Blair

In alcuni studi si sono valutati gli effetti protettivi di vari dispositivi di trasporto fino a 72 ore conservati sia a temperatura ambiente (T.A.) che a 4 °C. I tamponi a secco in generale non mantengono la vitalità dei microorganismi, tamponi con terreno di trasporto consentono la vitalità fino a 24 h a T.A. ma  solo tamponi con terreno di trasposto conservati a 4 °C consentono di ritrovare organismi vitali dopo 48-72 ore.

Tra i batteri più esigenti ricordiamo campylobacter, i micoplasmi, i micobatteri, le clamidie e i clostridi. Questi microrganismi richiedono temperature, condizioni ambientali e terreni di trasporto specifici.

• I campylobacter sono molto sensibili agli shock termici, quindi occorre evitare la refrigerazione e il congelamento. Richiedono inoltre terreni particolari quali Amies addizionato con carbone attivo.
• Le clamidie e i micoplasmi possono essere conservati e viaggiare refrigerati o congelati ma con terreni molto particolari forniti in genere dal laboratorio. Le clamidie inoltre vengono spesso eliminate in modo intermittente, quindi occorre fare più campionamenti e spedirli insieme (almeno tre tamponi cloacali o feci raccolte nell’arco di 5/7 giorni per es.). I tamponi con calcio-alginato potrebbero inibire la crescita delle clamidie, dacron e rayon sono da considerarsi fibre ideali per i batteriologici colturali.
• I clostridi invece, oltre a richiedere terreni di trasporto particolari (Amies al carbone), sono molto sensibili all’ossigeno, quindi occorre evitare il contatto prolungato con l’aria.

Esami micologici, parassitologici e citologici

Le modalità di prelievo e conservazione del campione sono diverse per esami micologici, parassitologici, citologici, istopatologici, virologici.

Per gli esami micologici si preferiscono tamponi a secco a temperatura ambiente, immessi direttamente in una provetta sterile vuota o in terreni selettivi. Il materiale deve essere prelevato durante la fase acuta della malattia, il prelievo si deve effettuare nelle zone sospette di micosi (raccolta di ife).

Nelle micosi superficiali, il prelievo va fatto dalle aree che presentano lesioni caratteristiche, l’animale inoltre non deve aver effettuato alcuna terapia antifungina locale. Nei soggetti  sottoposti a terapia il prelievo dovrà essere eseguito possibilmente dopo qualche giorno dall’ultimo trattamento.

Per gli esami parassitologici si possono prelevare campioni a temperatura ambiente o refrigerati o, per un’eventuale identificazione di specie, fissati in alcool al 70%.

Per gli esami citologici e la ricerca di emoparassiti quali Haemoproteus spp., Leucocitozoon spp., Plasmodium spp. si possono allestire preparati da colorare mediante impronta d’organo fresco (preferibilmente da polmone che rappresenta la matrice più idonea) o sangue su vetrino, che possono essere conservati e spediti a temperatura ambiente.

Esami istopatologici

Per le indagini istopatologiche i campioni vanno prelevati il prima possibile dopo la morte per evitare fenomeni autolitici, specie in organi ricchi di enzimi endogeni come il pancreas.

I campioni non vanno mai congelati per non alterare l’architettura dei tessuti, posti in formalina tamponata 10-15%, pezzetti di circa 1 cm³, rapporto di 1/10 minimo a temperatura ambiente (non refrigerare).

Esami virologici

Per gli esami virologici di tipo classico (isolamento in uova embrionate o colture cellulari) occorrono alcune accortezze:

• effettuare i prelievi nella fase acuta dell’infezione;
• prelevare organi da animali morti di recente;
• trasportare il campione nel più breve tempo possibile al laboratorio (entro 24-48 ore) in condizioni di refrigerazione, utilizzando idonei terreni di trasporto (diversi da quelli per batteri!).

Costo e convenienza

Gli esami colturali sono esami che richiedono una particolarissima attenzione nel campionamento e trasporto e in genere sono molto costosi.

Vanno richiesti per una finalità specifica (possibilità di caratterizzazione completa genotipica e fenotipica del microrganismo, produzione di vaccini stabulogeni, etc.) o quando non è possibile eseguire altre metodiche diagnostiche.

La consulenza del laboratorio

È sempre consigliabile che il veterinario clinico prenda contatto con il laboratorio di fiducia prima di effettuare il campionamento.

Oltre a queste indicazioni di valenza generale, data l’importanza che riveste la scelta dell’esame, l’allestimento, la conservazione e il trasporto del campione per effettuare una corretta diagnosi, è sempre consigliabile che il veterinario clinico prenda contatto con il laboratorio di fiducia prima di effettuare il campionamento.

Questo garantisce di non commettere errori che possono compromettere l’esito o l’esecuzione stessa dei test che si vogliono richiedere.

Presso l’Istituto Zooprofilattico Sperimentale delle Venezie i laboratori delle diverse strutture (diagnostica, batteriologia, parassitologia, virologia) sono a disposizione per fornire il supporto tecnico richiesto, ed eventualmente il materiale e i terreni più idonei per i vari esami.